Протокол детального пиросеквенирования NА-Н274 вируса гриппа А (H1N1) для тестирования восприимчивости вируса гриппа А (H1N1) к антивирусным препаратам

Пиросеквенирование гена NA для выявления резистентности к препарату озельтамивир (oseltamivir), обусловленной мутацией H274Y (H275Y в N1)

ОТ-ПЦР праймеры (20 мкм):

• Uni-sw-N1-B-F780, GGG GAA GAT TGT YAA ATC AGT YGA
• Uni-sw-N1-B-R1273-biot, CWA CCCA GAA RCA AGG YCT TAT G

Праймер последовательности (100 мкм):

• Uni-sw-N1-B-F804-seq, GYT GAA TGC MCC TAA TT

Протокол ОТ-ПЦР: Использование системы Invitrogen Superscript III одношаговой ОТ-ПЦР с HiFi Taq-полимеразой.

Параметры цикличности ПЦР:

Протокол пиросеквинирования: Использование PyroGold реагентов (для 96 образцов)

Реакция связывания

1. Связывающий буфер: 4 мл.
2. Дистиллированная вода (Н2О): 2 мл.
3. Гранулы сефарозы (хорошо перемешанные): 300 мкл.
4. Смесь, хорошо перемешанная в мешалке.
5. Внести 60 мкл связывающего буфера в каждую лунку чистого 96-луночного планшета для ОТ-ПЦР (использовать планшет с 12 рядами).
6. Добавить 20 мкл реагентов ОТ-ПЦР в соответствующие лунки, содержащие связывающий буфер.
7. Накрыть плашку фотолентой.
8. Потрясти плашку, по крайней мере, 10 минут.

Реакция отжига:

1. Буфер для отжига: 4.4 мл.
2. Праймер последовательности: 20мкл (Uni-sw-N1-B-F804-seq) на 100 мкм.
3. Перемешать в мешалке и добавить 40 мкл реакции отжига в каждую лунку 96-луночного мягкого планшета для пиросеквирования.

Порядок разделения: цикличный 60 (CATG\GT).

Используемый модуль: SQA (анализ последовательности).

Анализируемая последовательность:

274

ATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAG